激光技术已深人生命科学的各领域,利用激光能够在细胞层次和分子层次上研究生命运动。激光技术革新了传统的显微成像技术,提高了分辨率,并使细胞微观结构的立体显示得以实现;激光技术使细胞、细胞器和细胞表面特性的研究从定性走人定量发展阶段,高速分选细胞群体和染色体的技术实现了,世界上第一次建立起了染色体库,这一技术正在发展成为分子生物学和遗传学揭开生命奥秘的脱氧核糖核酸(DNA)高速定序技术。x波段激光已经出现,以它为光源的全息技术将改变显微成像和体现技术和现状,掀起一场人体透视和细胞成像的技术革命。激光技术在生命科学的发展中起着极重要的作用。
1.直接观察微观世界
共焦扫描光学显微镜(CSOM)是光学显微镜的新的发展方向。在常规显微镜中是由物镜形成物视场的整个放大像,而CSOM是用照明针孔来回扫描物体一点接着一点地成像的。图描单元圆了+ la 激光穿过针孔以衍射极限光点成像于物镜的物平面上。从样品反射的光通过光学系统穿过第二个针孔的而到达探测器。然而,只有当第二个针孔严格地位于第一个针孔的共轭像处时,从样品上该光点反射的光才能到达探测器。样品的整个像是由光点在物平面上扫描而一点接着一点地形成的。于
外围光不能穿过探测器针孔,厚样品的CSOM图像不舍损失清晰和反差。一点接着一点地成像还有利于计算机处理。利用这些优点,CSOM可以建立物体的三维图像,只要将扫描获得的两维图像一层层地堆积起来即可。一点接着一点地扫描成像毕竟很耗时,但是通过一个转盘上咸千千针孔连续地扫描物体,某些CSOM可以进行“实时”显微。
CSOM正在国际人类染色体计划中作出卓越的贡献,该计划的目的是确定人类DNA内每种基因的定位和化学结构。DNA定序的速度对于该计划的完成是至关重要的,CSOM能使电泳分析微型化,方法是用光刻掩模和化学刻蚀技术在平面玻璃基底上做成毛细管电泳阵列,CSOM的Ar+激光在DNA移动通过毛细管时扫描DNA,结果表明这种方法比典型的毛细管电泳技术快约10倍。CSOM还可以用来研究在化学溶液中移动和反应的个别分子,可以直接地、实时地看到单个分子的行为。
尽管CSOM有很多优点,它的横向分辨率仍受到激光的衍射极限宽度的限制,最终与激光的波长有关,约为λ/2。但是,最近一种称为近场扫描光学显微镜(NSOM)的显微镜脱颖而出,打破了与波长有关的分辨率这个一度不可逾越的壁晶,NSOM的基本思想是通过很小的针孔照明待观察的样品,并将光点扫描样品。如果针孔小于照明光的波长,并且针孔离样品仅几个纳米以内(近场),则显微的分辨率极限主要由针孔直径确定。现在NSOM已可进行超高分辨率的透射、反射、偏振,折射率和荧光成像,分辨率已达A/20,并可实现超高分辨率光谱学和单分子探测。
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